액체 크로마토그래피에 의한 정량 분석의 원리 및 방법

액체 크로마토그래피의 분리 메커니즘은 두 상에 대한 혼합물 내 성분의 친화력 차이에 기초합니다.

액체 크로마토그래피는 고정상의 종류에 따라 액체-고체 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피, 결합상 크로마토그래피로 구분됩니다.가장 널리 사용되는 것은 실리카겔을 필러로 사용하는 액체-고체 크로마토그래피와 마이크로실리카를 매트릭스로 사용하는 결합상 크로마토그래피입니다.

액체 크로마토그래피는 고정상의 형태에 따라 컬럼 크로마토그래피, 종이 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피로 나눌 수 있습니다.흡착 능력에 따라 흡착 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피로 나눌 수 있습니다.

최근에는 액체 컬럼 크로마토그래피 시스템에 고압 액체 흐름 시스템을 추가하여 고압 하에서 이동상을 빠르게 흐르게 하여 분리 효과를 향상시켜 고효율(고압이라고도 함) 액체 크로마토그래피를 구현하고 있습니다. 등장했습니다.

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01 액체 크로마토그래피의 정량분석 원리

정성적인 기준으로 정량화하기 위해서는 순물질을 기준으로 삼아야 합니다.

액체 크로마토그래피 정량화는 상대적으로 정량적인 방법입니다. 즉, 알려진 양의 순수 표준 시료로부터 혼합물 내 분석물의 양을 추정합니다.

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02 액체 크로마토그래피에 의한 정량의 기초

측정된 성분(W)의 양은 응답 값(A)(피크 높이 또는 피크 면적)에 비례하며 W=f×A입니다.

정량보정계수(f) : 정량계산식의 비례상수로, 물리적 의미는 단위반응값(피크면적)으로 표현되는 측정성분의 양을 말한다.

정량적 보정 계수는 알려진 표준 샘플의 양과 해당 반응 값으로부터 얻을 수 있습니다.

미지의 성분에 대한 반응값을 측정하고, 정량적 보정계수에 의해 성분의 양을 구할 수 있다.

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03 정량분석의 공통용어

샘플(sample): 크로마토그래피 분석을 위한 분석물을 함유한 용액.표준시료와 미지시료로 구분됩니다.

표준(Standard): 농도가 알려진 순수한 제품.알 수 없는 샘플(알 수 없음): 농도를 테스트할 혼합물입니다.

샘플 중량: 테스트할 샘플의 원래 중량입니다.

희석: 미지 시료의 희석 인자입니다.

성분(Component) : 정량적으로 분석하고자 하는 크로마토그래피의 피크, 즉 함량을 알 수 없는 분석물질.

성분량(amount) : 시험할 물질의 함량(또는 농도)을 말한다.

무결성(Integerity): 컴퓨터로 크로마토그래피 피크의 피크 면적을 측정하는 계산 과정입니다.

교정 곡선(Calibration curve): 알려진 양의 표준 물질로부터 확립된 성분 함량 대 반응 값의 선형 곡선으로, 분석물의 알려지지 않은 함량을 결정하는 데 사용됩니다.

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04 액체 크로마토그래피의 정량분석

1. 정량 분석에 적합한 크로마토그래피 방법을 선택합니다.

l 감지된 성분의 피크를 확인하고 1.5보다 큰 분해능(R)을 달성합니다.

l 테스트된 구성 요소의 크로마토그래피 피크의 일관성(순도)을 결정합니다.

l 분석법의 검출 한계와 정량 한계를 결정합니다.감도 및 선형 범위

2. 다양한 농도의 표준 시료로 검량선 작성

3. 정량적 방법의 정확성과 정밀도를 확인합니다.

4. 해당 크로마토그래피 관리 소프트웨어를 사용하여 샘플 수집, 데이터 처리 및 결과 보고를 구현합니다.

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05 정량적 피크 식별(정성적)

정량화할 각 크로마토그래피 피크를 정성적으로 식별합니다.

먼저, 표준 샘플을 사용하여 정량화할 크로마토그래피 피크의 머무름 시간(Rt)을 결정합니다.머무름 시간을 비교하여 미지 시료의 각 크로마토그래피 피크에 해당하는 성분을 찾습니다.크로마토그래피 정성적 방법은 표준 시료와 머무름 시간을 비교하는 것입니다.기준이 불충분하다추가 확인(정성적)

1. 표준물질 첨가방법

2. 동시에 다른 방법을 사용하십시오: 다른 크로마토그래피 방법(다른 크로마토그래피 컬럼 사용과 같은 메커니즘 변경), 기타 검출기(PDA: 스펙트럼 비교, 스펙트럼 라이브러리 검색, MS: 질량 스펙트럼 분석, 스펙트럼 라이브러리 검색)

3. 기타 기구 및 방법

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06 정량적 피크 일관성 확인

크로마토그래피 피크 일관성(순도) 확인

각 크로마토그래피 피크 아래에 측정된 구성 요소가 하나만 있는지 확인하십시오.

동시 용출 물질(불순물)로 인한 간섭 확인

크로마토그래피 피크 일관성(순도) 확인 방법

포토다이오드 매트릭스(PDA) 검출기와 스펙트로그램 비교

최고 순도 식별

2996 순도각 이론

PART 07에서 일반적으로 사용되는 정량적 방법

외부 표준 방법과 내부 표준 방법으로 구분되는 표준 곡선 방법:

1. 외부 표준법: 액체 크로마토그래피에서 가장 많이 사용됨

알려진 농도의 일련의 표준 샘플은 표준 샘플로 테스트할 화합물의 순수 샘플을 사용하여 준비되었습니다.반응 값(피크 면적)까지 컬럼에 주입됩니다.
일정 범위 내에서는 표준시료의 농도와 반응값 사이에 좋은 선형 관계, 즉 W=f×A가 존재하여 표준곡선이 작성됩니다.

정확히 동일한 실험 조건에서 미지의 샘플을 주입하여 측정할 구성 요소의 응답 값을 얻습니다.알려진 계수 f 에 따라 측정하려는 성분의 농도를 얻을 수 있습니다.

외부 표준 방법의 장점:간단한 조작과 계산으로 일반적으로 사용되는 정량적 방법입니다.각 성분을 검출하고 용출할 필요가 없습니다.표준 샘플이 필요합니다.표준 시료와 미지 시료의 측정 조건은 일관되어야 합니다.주입량이 정확해야 합니다.

외부 표준 방법의 단점:검출기의 감도, 유속, 이동상의 구성을 변경할 수 없는 등 실험 조건이 높아야 합니다.각 주입량의 반복성이 좋아야 합니다.

2. 내부표준방법: 정확하지만 번거로움, 표준 방법에서 가장 많이 사용됨

알려진 양의 내부 표준이 표준에 추가되어 혼합 표준을 만들고 알려진 농도의 일련의 작업 표준이 준비됩니다.혼합 표준의 내부 표준에 대한 표준의 몰 비율은 변하지 않습니다.크로마토그래피 컬럼에 주입하고 (표준 샘플 피크 영역/내부 표준 샘플 피크 영역)을 응답 값으로 사용합니다.반응값과 작업 표준물질의 농도 사이의 선형 관계, 즉 W= f×A에 따라 표준 곡선이 만들어집니다.

알려진 양의 내부 표준물질을 미지의 시료에 추가하고 컬럼에 주입하여 측정할 구성 요소의 반응 값을 얻습니다.알려진 계수 f 에 따라 측정하려는 성분의 농도를 얻을 수 있습니다.

내부 표준법의 특징:작업 중에 샘플과 내부 표준이 함께 혼합되어 크로마토그래피 컬럼에 주입되므로 혼합 용액에서 측정된 성분의 양과 내부 표준의 비율이 일정한 한 샘플 부피의 변화가 발생합니다. 정량적 결과에는 영향을 미치지 않습니다..내부 표준 방법은 시료량은 물론 이동상 및 검출기의 영향도 상쇄하므로 외부 표준 방법보다 더 정확합니다.

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08 정량분석 결과에 영향을 미치는 요소

정확도가 떨어지는 원인은 다음과 같습니다.

잘못된 피크 면적 통합, 시료 준비 중에 시료 분해 또는 불순물 유입, 밀봉되지 않은 시료 바이알, 시료 또는 용매 휘발, 잘못된 시료 준비, 시료 주입 문제, 잘못된 내부 표준물질 준비

정밀도가 낮은 가능한 이유:

잘못된 피크 적분, 주입 또는 주입기 문제, 시료 준비 중 시료 분해 또는 불순물 유입, 크로마토그래피 문제, 검출기 반응 저하