액체 크로마토그래피는 원료, 중간체, 조제품, 포장재 등의 각 성분과 불순물의 함량을 검사하는 주요 방법이지만, 많은 물질이 신뢰할 수 있는 표준 방법이 없기 때문에 새로운 방법 개발이 불가피합니다. 액상 분석법 개발에 있어서 크로마토그래피 컬럼은 액체 크로마토그래피의 핵심이므로 적합한 크로마토그래피 컬럼을 선택하는 방법이 중요합니다. 이 기사에서 저자는 전반적인 아이디어, 고려 사항 및 적용 범위라는 세 가지 측면에서 액체 크로마토그래피 컬럼을 선택하는 방법을 설명합니다.
A.액체 크로마토그래피 컬럼 선택에 대한 전반적인 아이디어
1. 화학구조, 용해도, 안정성(예: 산화/환원/가수분해되기 쉬운지 여부), 산도 및 알칼리도 등 분석물질의 물리화학적 특성을 평가합니다. 특히 화학구조가 핵심입니다. 공액기가 강한 자외선 흡수 및 강한 형광을 갖는 등의 특성을 결정하는 요인;
2. 분석 목적을 결정합니다. 높은 분리도, 높은 컬럼 효율성, 짧은 분석 시간, 높은 감도, 높은 압력 저항, 긴 컬럼 수명, 저렴한 비용 등이 필요한지 여부를 결정합니다.
- 적합한 크로마토그래피 컬럼 선택: 입자 크기, 기공 크기, 온도 내성, pH 내성, 분석물질 흡착 등과 같은 크로마토그래피 필러의 구성, 물리적, 화학적 특성을 이해합니다.
- 액체 크로마토그래피 컬럼 선택 시 고려 사항
본 장에서는 크로마토그래피 컬럼 자체의 물리적, 화학적 특성의 관점에서 크로마토그래피 컬럼을 선택할 때 고려해야 할 요소에 대해 논의합니다. 2.1 필러 매트릭스
2.1.1 실리카겔 매트릭스 대부분의 액체 크로마토그래피 컬럼의 필러 매트릭스는 실리카겔입니다. 이러한 유형의 필러는 순도가 높고 비용이 저렴하며 기계적 강도가 높으며 그룹(예: 페닐 결합, 아미노 결합, 시아노 결합 등)을 쉽게 수정할 수 있지만 허용되는 pH 값과 온도 범위는 제한됩니다. 대부분의 실리카겔 매트릭스 필러의 pH 범위는 2~8이지만 특별히 변형된 실리카겔 결합상의 pH 범위는 1.5~10까지 넓을 수 있으며 낮은 pH에서도 안정한 특별히 변형된 실리카겔 결합상의 경우도 있습니다. 그런 pH 1~8에서 안정한 Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18; 실리카겔 매트릭스의 온도 상한은 일반적으로 60℃이며 일부 크로마토그래피 컬럼은 높은 pH에서 40℃의 온도를 견딜 수 있습니다.
2.1.2 폴리머 매트릭스 폴리머 필러는 대부분 폴리스티렌-디비닐벤젠 또는 폴리메타크릴레이트입니다. 이들의 장점은 넓은 pH 범위를 견딜 수 있다는 것입니다. 즉, 1~14 범위에서 사용할 수 있으며 고온(80°C 이상에 도달할 수 있음)에 더 잘 견딥니다. 실리카 기반의 C18 필러와 비교하여 이러한 유형의 필러는 소수성이 더 강하며 거대 다공성 폴리머는 단백질과 같은 시료를 분리하는 데 매우 효과적입니다. 단점은 실리카계 필러에 비해 컬럼 효율이 낮고 기계적 강도도 약하다는 점이다. 2.2 입자 모양
대부분의 최신 HPLC 필러는 구형 입자이지만 불규칙한 입자인 경우도 있습니다. 구형 입자는 더 낮은 컬럼 압력, 더 높은 컬럼 효율성, 안정성 및 더 긴 수명을 제공할 수 있습니다. 고점도 이동상(예: 인산)을 사용하거나 시료 용액이 점성일 때 불규칙한 입자는 더 큰 비표면적을 가지므로 두 상의 전체 작용에 더 도움이 되며 가격이 상대적으로 낮습니다. 2.3 입자 크기
입자 크기가 작을수록 컬럼 효율이 높아지고 분리도는 높아지지만 내압성은 나빠집니다. 가장 일반적으로 사용되는 컬럼은 5μm 입자 크기 컬럼입니다. 분리 요구 사항이 높은 경우 1.5-3μm 필러를 선택할 수 있으며 이는 일부 복잡한 매트릭스 및 다중 구성 요소 샘플의 분리 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다. UPLC는 1.5μm 필러를 사용할 수 있습니다. 10μm 이상의 입자 크기 필러는 semi-preparative 또는 preparative 컬럼에 사용되는 경우가 많습니다. 2.4 탄소 함량
탄소 함량은 실리카겔 표면의 결합상의 비율을 말하며, 이는 비표면적 및 결합상의 적용 범위와 관련이 있습니다. 높은 탄소 함량은 높은 컬럼 용량과 높은 분리능을 제공하며 높은 분리가 필요한 복잡한 시료에 자주 사용되지만 두 상 간의 상호 작용 시간이 길어 분석 시간이 길어집니다. 저탄소 함량 크로마토그래피 컬럼은 분석 시간이 짧고 다양한 선택성을 나타낼 수 있으며, 빠른 분석이 필요한 단순 시료와 높은 수용액상 조건이 필요한 시료에 자주 사용됩니다. 일반적으로 C18의 탄소 함량은 7%~19%입니다. 2.5 기공크기와 비표면적
HPLC 흡착 매체는 다공성 입자이며 대부분의 상호 작용은 기공에서 발생합니다. 따라서 분자가 기공으로 들어가 흡착 및 분리되어야 합니다.
기공 크기와 비표면적은 두 가지 보완적인 개념입니다. 기공 크기가 작다는 것은 비표면적이 크다는 것을 의미하며, 그 반대도 마찬가지입니다. 큰 비표면적은 시료 분자와 결합상 사이의 상호 작용을 증가시키고, 머무름을 강화하며, 시료 로딩 및 컬럼 용량을 늘리고, 복잡한 구성 요소를 분리할 수 있습니다. 완전 다공성 필러는 이러한 유형의 필러에 속합니다. 분리 요구 사항이 높은 경우 비표면적이 큰 필러를 선택하는 것이 좋습니다. 비표면적이 작으면 배압이 감소하고, 컬럼 효율이 향상되며, 평형 시간이 단축되므로 기울기 분석에 적합합니다. 코어쉘 필러는 이러한 유형의 필러에 속합니다. 분리를 보장한다는 전제 하에 높은 분석 효율성이 요구되는 경우에는 비표면적이 작은 필러를 선택하는 것이 좋습니다. 2.6 기공 부피와 기계적 강도
기공 부피는 "기공 부피"라고도 알려져 있으며 단위 입자당 공극 부피의 크기를 나타냅니다. 이는 필러의 기계적 강도를 잘 반영할 수 있습니다. 기공 부피가 큰 필러의 기계적 강도는 기공 부피가 작은 필러보다 약간 약합니다. HPLC 분리에는 기공 부피가 1.5 mL/g 이하인 필러가 주로 사용되며, 분자 배제 크로마토그래피 및 저압 크로마토그래피에는 기공 부피가 1.5 mL/g 이상인 필러가 주로 사용됩니다. 2.7 상한율
캡핑은 화합물과 노출된 실라놀 그룹 간의 상호 작용(예: 알칼리성 화합물과 실라놀 그룹 간의 이온 결합, 산성 화합물과 실라놀 그룹 간의 반 데르 발스 힘 및 수소 결합)으로 인해 발생하는 테일링 피크를 줄여 컬럼 효율성과 피크 모양을 개선할 수 있습니다. . 캡이 없는 결합상은 특히 극성 샘플의 경우 캡이 있는 결합상에 비해 선택성이 다릅니다.
- 다양한 액체 크로마토그래피 컬럼의 적용 범위
이 장에서는 다양한 유형의 액체 크로마토그래피 컬럼의 적용 범위를 몇 가지 사례를 통해 설명합니다.
3.1 역상 C18 크로마토그래피 컬럼
C18 컬럼은 가장 일반적으로 사용되는 역상 컬럼으로 대부분의 유기 물질의 함량 및 불순물 테스트를 충족할 수 있으며 중극성, 약극성 및 비극성 물질에 적용 가능합니다. C18 크로마토그래피 컬럼의 유형과 사양은 특정 분리 요구 사항에 따라 선택해야 합니다. 예를 들어 분리 요구 사항이 높은 물질의 경우 5μm*4.6mm*250mm 사양이 자주 사용됩니다. 분리 매트릭스가 복잡하고 극성이 유사한 물질의 경우 4μm*4.6mm*250mm 사양 또는 더 작은 입자 크기를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 저자는 celecoxib API에서 두 가지 유전독성 불순물을 검출하기 위해 3μm*4.6mm*250mm 컬럼을 사용했습니다. 두 물질의 분리는 2.9에 도달할 수 있으며 이는 매우 우수합니다. 또한 분리를 보장한다는 전제 하에 신속한 분석이 필요한 경우에는 10mm나 15mm의 짧은 컬럼을 선택하는 경우가 많습니다. 예를 들어, 저자가 인산피페라퀸 API의 유전독성 불순물을 검출하기 위해 LC-MS/MS를 사용할 때 3μm*2.1mm*100mm 컬럼을 사용했습니다. 불순물과 주성분의 분리도는 2.0으로 5분만에 시료검출이 완료됩니다. 3.2 역상 페닐 컬럼
페닐 컬럼은 역상 컬럼의 한 유형이기도 합니다. 이 유형의 컬럼은 방향족 화합물에 대해 강력한 선택성을 갖습니다. 일반 C18 컬럼으로 측정한 방향족 화합물의 반응이 약한 경우 페닐 컬럼 교체를 고려해 볼 수 있습니다. 예를 들어, 제가 celecoxib API를 만들 때, 같은 제조사, 같은 사양의 페닐 컬럼(모두 5μm*4.6mm*250mm)으로 측정한 주성분 반응이 C18 컬럼의 약 7배였습니다. 3.3 순상 컬럼
순상 컬럼은 역상 컬럼의 효과적인 보완책으로 극성이 높은 화합물에 적합합니다. 역상 컬럼에서 90% 이상의 수성상으로 용출할 때 피크가 여전히 매우 빠르며 심지어 용매 피크에 가깝거나 겹치는 경우 순상 컬럼 교체를 고려할 수 있습니다. 이러한 유형의 컬럼에는 Hilic 컬럼, 아미노 컬럼, 시아노 컬럼 등이 포함됩니다.
3.3.1 Hilic 컬럼 Hilic 컬럼은 일반적으로 결합된 알킬 사슬에 친수성 그룹을 삽입하여 극성 물질에 대한 반응을 향상시킵니다. 이 유형의 컬럼은 설탕 물질 분석에 적합합니다. 저자는 자일로스 및 그 유도체의 내용과 관련 물질을 다룰 때 이런 유형의 칼럼을 사용했습니다. 자일로스 유도체의 이성질체도 잘 분리될 수 있습니다.
3.3.2 아미노 컬럼 및 시아노 컬럼 아미노 컬럼 및 시아노 컬럼은 각각 결합된 알킬 사슬의 끝에 아미노 및 시아노 변형을 도입하여 특수 물질에 대한 선택성을 향상시키는 것을 의미합니다. 예를 들어 아미노 컬럼은 좋은 선택입니다. 당, 아미노산, 염기 및 아미드의 분리용; 시아노 컬럼은 공액 결합의 존재로 인해 수소화된 및 수소화되지 않은 구조적 유사 물질을 분리할 때 더 나은 선택성을 갖습니다. 아미노 컬럼과 시아노 컬럼은 순상 컬럼과 역상 컬럼을 전환할 수 있는 경우가 많지만 자주 전환하는 것은 권장되지 않습니다. 3.4 키랄 컬럼
키랄 컬럼은 이름에서 알 수 있듯이 특히 의약품 분야에서 키랄 화합물의 분리 및 분석에 적합합니다. 이러한 유형의 컬럼은 기존의 역상 및 순상 컬럼이 이성질체 분리를 달성할 수 없는 경우에 고려될 수 있습니다. 예를 들어, 저자는 5 μm*4.6 mm*250 mm 키랄 컬럼을 사용하여 1,2-디페닐에틸렌디아민의 두 이성질체인 (1S, 2S)-1, 2-디페닐에틸렌디아민과 (1R, 2R)-1, 2를 분리했습니다. -디페닐에틸렌디아민, 그리고 둘 사이의 분리는 약 2.0에 도달했습니다. 그러나 키랄 컬럼은 다른 유형의 컬럼보다 가격이 더 비쌉니다(보통 1W+/개). 그러한 기둥이 필요하다면 해당 부서에서는 충분한 예산을 확보해야 합니다. 3.5 이온 교환 컬럼
이온 교환 컬럼은 이온, 단백질, 핵산 및 일부 당 물질과 같은 하전 이온의 분리 및 분석에 적합합니다. 필러 종류에 따라 양이온 교환탑, 음이온 교환탑, 강양이온 교환탑으로 구분됩니다.
양이온 교환 컬럼에는 칼슘 기반 컬럼과 수소 기반 컬럼이 있으며 주로 아미노산과 같은 양이온 물질 분석에 적합합니다. 예를 들어, 저자는 플러싱 용액에서 글루콘산칼슘과 아세트산칼슘을 분석할 때 칼슘 기반 컬럼을 사용했습니다. 두 물질 모두 λ=210nm에서 강한 반응을 보였으며 분리도는 3.0에 도달했습니다. 저자는 포도당 관련 물질을 분석할 때 수소 기반 컬럼을 사용했습니다. 몇몇 주요 관련 물질인 맥아당, 말토트리오스 및 과당은 차등 검출기에서 높은 감도를 나타냈으며 검출 한계는 0.5ppm으로 낮고 분리 정도는 2.0-2.5였습니다.
음이온 교환 컬럼은 주로 유기산 및 할로겐 이온과 같은 음이온 물질의 분석에 적합합니다. 강한 양이온 교환 컬럼은 이온 교환 용량과 선택성이 높아 복잡한 시료의 분리 및 분석에 적합합니다.
위 내용은 저자 자신의 경험을 결합하여 흔히 사용되는 여러 가지 액체 크로마토그래피 컬럼의 종류와 적용 범위를 소개한 것에 불과합니다. 실제 응용 분야에는 큰 기공 크로마토그래피 컬럼, 작은 기공 크로마토그래피 컬럼, 친화성 크로마토그래피 컬럼, 다중 모드 크로마토그래피 컬럼, 초고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(UHPLC), 초임계 유체 크로마토그래피 컬럼과 같은 다른 특수 유형의 크로마토그래피 컬럼이 있습니다( SFC) 등 다양한 분야에서 중요한 역할을 합니다. 특정 유형의 크로마토그래피 컬럼은 시료의 구조와 특성, 분리 요구 사항 및 기타 목적에 따라 선택해야 합니다.
게시 시간: 2024년 6월 14일